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電泳實驗中的坑?看完這篇你就懂了!

更新時間:2024-10-30 瀏覽次數(shù):838次
   電泳技術就是利用在電場的作用下,由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異,使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度,從而對樣品進行分離、鑒定或提純的技術。
  經(jīng)常做電泳實驗的同學,是否會經(jīng)常遇到各種各樣的問題,不管是核酸還是蛋白電泳,然后找不到解決方法?
  今天大龍君整理了電泳實驗中經(jīng)常遇到的問題,幫助大家更加直觀的識別實驗中的“疑難雜癥”。
  一、DNA電泳常見問題分析
  1、跑出的DNA帶模糊?
  可能原因1:DNA降解
  解決方法:避免核酸酶污染
  可能原因2:電泳緩沖液陳舊
  解決方法:電泳緩沖液多次使用后,離子強度降低,pH值上升,緩沖能力減弱,從而影響電泳效果。建議經(jīng)常更換電泳緩沖液
  可能原因3:所用電泳條件不合適
  解決方法:電泳時電壓不應超過20V/cm,溫度<30℃;巨大DNA鏈電泳,溫度應<15℃;核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力
  可能原因4:DNA上樣量過多
  解決方法:減少凝膠中DNA上樣量
  可能原因5:DNA樣含鹽過高
  解決方法:電泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽
  可能原因6:有蛋白污染
  解決方法:電泳前酚抽提去除蛋白
  可能原因7:DNA變性
  解決方法:電泳前勿加熱,用20mM NaCl緩沖液稀釋DNA
  2、有DNA帶遷移?
  可能原因:1對于λ/Hind III片段cos位點復性
  解決方法:電泳前于65℃加熱DNA 5分鐘,然后在冰上冷卻5分鐘
  可能原因2:電泳條件不合適
  解決方法:電泳電壓不超過20V/cm;溫度<30℃;經(jīng)常更換電泳緩沖液
  可能原因3:DNA變性
  解決方法:以20mM NaCl Buffer稀釋DNA,電泳前勿加熱
  3、跑出的DNA帶弱或無DNA帶?
  可能原因1:DNA的上樣量不夠
  解決方法:增加DNA的上樣量;聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏度稍高,上樣量可適當降低
  可能原因2:DNA降解
  解決方法:避免DNA的核酸酶污染
  可能原因3:DNA走出凝膠
  解決方法:縮短電泳時間,降低電壓,增強凝膠濃度
  可能原因4:對于EB染色的DNA,所用光源不合適
  解決方法:應用短波長(254nm)的紫外光源
  4、跑出的DNA帶缺失?
  可能原因1:小DNA帶走出凝膠
  解決方法:縮短電泳時間,降低電壓,增強凝膠濃度
  可能原因2:分子大小相近的DNA帶不易分辨
  解決方法:增加電泳時間,核準正確的凝膠濃度
  可能原因3:DNA變性
  解決方法:電泳前請勿高溫加熱DNA鏈,以20mM NaCl Buffer稀釋DNA
  可能原因4:DNA鏈巨大,常規(guī)凝膠電泳不合適
  解決方法:在脈沖凝膠電泳上分析
  二、SDS-PAGE凝膠電泳和Western轉移常見問題
  1、電泳時間過長
  可能原因:電泳緩沖液稀,或使用次數(shù)過多
  解決方法:更換新鮮1×緩沖液
  2、電泳電流過高
  可能原因:電泳緩沖液稀,或使用次數(shù)過多
  解決方法:更換新鮮1×緩沖液
  3、條帶模糊
  可能原因1:樣品部分變性
  解決方法:變性蛋白質(zhì)
  可能原因2:樣品部分降解
  解決方法:優(yōu)化蛋白質(zhì)提取過程,如采用低溫,加入蛋白酶抑制劑等
  4、蛋白帶呈條狀
  可能原因1:樣品中陽離子含量過高
  解決方法:通過透析、凝膠過濾等方法去除陽離子干擾
  可能原因2:樣品中含污染物,如:DNA、多糖、脂類等
  解決方法:優(yōu)化提取方法,如提取緩沖液配比,離心,過濾等
  可能原因3:樣品沉淀
  解決方法:通過加熱樣品或增加SDS濃度促進樣品溶解或離心除去蛋白質(zhì)沉淀
  可能原因4:上樣量過高
  解決方法:減少上樣量
  可能原因5:制備凝膠
  解決方法:配置凝膠液時要混勻;灌膠要連續(xù)
  5、蛋白帶呈“微笑”狀
  可能原因1:各泳道間蛋白質(zhì)含量差異過大,導致電場不均勻
  解決方法:測定蛋白質(zhì)含水量,使樣品間蛋白質(zhì)含量一致
  可能原因2:上樣量過大,導致不堆積
  解決方法:使用適當上樣量,如樣量過稀,采用冷凍干燥或超濾方法濃縮
  可能原因3:凝膠表面或分離膠表面不平
  解決方法:檢查藥品是否過期,制備凝膠時使凝膠表面平整
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