電泳技術就是利用在電場的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而對樣品進行分離、鑒定或提純的技術。
經(jīng)常做電泳實驗的同學，是否會經(jīng)常遇到各種各樣的問題，不管是核酸還是蛋白電泳，然后找不到解決方法？
今天大龍君整理了電泳實驗中經(jīng)常遇到的問題，幫助大家更加直觀的識別實驗中的“疑難雜癥”。
一、DNA電泳常見問題分析
1、跑出的DNA帶模糊？
可能原因1：DNA降解
解決方法：避免核酸酶污染
可能原因2：電泳緩沖液陳舊
解決方法：電泳緩沖液多次使用后，離子強度降低，pH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果。建議經(jīng)常更換電泳緩沖液
可能原因3：所用電泳條件不合適
解決方法：電泳時電壓不應超過20V/cm，溫度＜30℃；巨大DNA鏈電泳，溫度應＜15℃；核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力
可能原因4：DNA上樣量過多
解決方法：減少凝膠中DNA上樣量
可能原因5：DNA樣含鹽過高
解決方法：電泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽
可能原因6：有蛋白污染
解決方法：電泳前酚抽提去除蛋白
可能原因7：DNA變性
解決方法：電泳前勿加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋DNA
2、有DNA帶遷移？
可能原因：1對于λ/Hind III片段cos位點復性
解決方法：電泳前于65℃加熱DNA 5分鐘，然后在冰上冷卻5分鐘
可能原因2：電泳條件不合適
解決方法：電泳電壓不超過20V/cm；溫度＜30℃；經(jīng)常更換電泳緩沖液
可能原因3：DNA變性
解決方法：以20mM NaCl Buffer稀釋DNA，電泳前勿加熱
3、跑出的DNA帶弱或無DNA帶？
可能原因1：DNA的上樣量不夠
解決方法：增加DNA的上樣量；聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏度稍高，上樣量可適當降低
可能原因2：DNA降解
解決方法：避免DNA的核酸酶污染
可能原因3：DNA走出凝膠
解決方法：縮短電泳時間，降低電壓，增強凝膠濃度
可能原因4：對于EB染色的DNA，所用光源不合適
解決方法：應用短波長（254nm）的紫外光源
4、跑出的DNA帶缺失？
可能原因1：小DNA帶走出凝膠
解決方法：縮短電泳時間，降低電壓，增強凝膠濃度
可能原因2：分子大小相近的DNA帶不易分辨
解決方法：增加電泳時間，核準正確的凝膠濃度
可能原因3：DNA變性
解決方法：電泳前請勿高溫加熱DNA鏈，以20mM NaCl Buffer稀釋DNA
可能原因4：DNA鏈巨大，常規(guī)凝膠電泳不合適
解決方法：在脈沖凝膠電泳上分析
二、SDS-PAGE凝膠電泳和Western轉移常見問題
1、電泳時間過長
可能原因：電泳緩沖液稀，或使用次數(shù)過多
解決方法：更換新鮮1×緩沖液
2、電泳電流過高
可能原因：電泳緩沖液稀，或使用次數(shù)過多
解決方法：更換新鮮1×緩沖液
3、條帶模糊
可能原因1：樣品部分變性
解決方法：變性蛋白質(zhì)
可能原因2：樣品部分降解
解決方法：優(yōu)化蛋白質(zhì)提取過程，如采用低溫，加入蛋白酶抑制劑等
4、蛋白帶呈條狀
可能原因1：樣品中陽離子含量過高
解決方法：通過透析、凝膠過濾等方法去除陽離子干擾
可能原因2：樣品中含污染物，如：DNA、多糖、脂類等
解決方法：優(yōu)化提取方法，如提取緩沖液配比，離心，過濾等
可能原因3：樣品沉淀
解決方法：通過加熱樣品或增加SDS濃度促進樣品溶解或離心除去蛋白質(zhì)沉淀
可能原因4：上樣量過高
解決方法：減少上樣量
可能原因5：制備凝膠
解決方法：配置凝膠液時要混勻；灌膠要連續(xù)
5、蛋白帶呈“微笑”狀
可能原因1：各泳道間蛋白質(zhì)含量差異過大，導致電場不均勻
解決方法：測定蛋白質(zhì)含水量，使樣品間蛋白質(zhì)含量一致
可能原因2：上樣量過大，導致不堆積
解決方法：使用適當上樣量，如樣量過稀，采用冷凍干燥或超濾方法濃縮
可能原因3：凝膠表面或分離膠表面不平
解決方法：檢查藥品是否過期，制備凝膠時使凝膠表面平整
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更新時間：2024-10-30
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